In vitro apaugļošanās (IVF) ceļā iegūtu embriju bioloģiskā materiāla sagatavošana preimplantācijas ģenētiskai diagnostikai (PGD)

Ievietots: 01.04.2016.

 

Izvērsts medicīnas tehnoloģijas metodes apraksts

IN VITRO APAUGĻOŠANĀS (IVF) CEĻĀ IEGŪTU EMBRIJU

BIOLOĢISKĀ MATERIĀLA SAGATAVOŠANA

PREIMPLANTĀCIJAS ĢENĒTISKAI DIAGNOSTIKAI (PGD)

 

  1. I. Vispārējā informācija

Preimplantācijas ģenētiskā diagnostika (PGD) ir metode, kas ļauj pāriem, kuriem pastāv ģenētiski pārmantotu slimību risks, izvairīties no izmainīto gēnu pārmantošanas tālāk pēctečos, kā arī izslēgt embriju hromosomālās anomālijas ārpusķermeņa apaugļošanas (IVF) laikā.

PGD kopā ar IVF metodi sniedz  iespēju ģenētisku izmaiņu pārnēsātājiem palikt stāvoklī un dzemdēt veselus bērnus, veicot embrija testēšanu vēl pirms tā implantācijas dzemdē. Tādejādi, topošie vecāki var izvairīties no smagas dilemmas: vai pārtraukt grūtniecību, vai laist pasaulē slimu bērnu. Īpaši, ja šāda slimība izpaužas nevis uzreiz, bet cilvēka dzīves gaitā (kā, piemēram, Hantingtona slimība, Alcheimera slimība, RB1- retinoblastoma, BRCA1 un BRCA2 – ģimenes krūts un olnīcu vēzis, NF1 in NF2 – neirofibromatoze u.c.). ASV ir aprēķināts, ja pastāvētu nacionāla IVF-PGD programma cistiskās fibrozes gēna nesēju testēšanai un slimības prevencijai,  valsts varētu ietaupīt uz pacientu iespējami slimo bērnu ārstēšanas rēķina miljonus dolāru.

Saskaņā ar daudzu pasaules vadošo IVF klīniku datiem, pirmsimplantācijas embrijiem, kas iegūti IVF  pēc ovariālās hiperstimulācijas, ir samērā liels hromosomālo anomāliju procents. Atkarībā no sievietes vecuma, spermogrammas rādītājiem un citiem faktoriem (neauglības cēloņi, neiznēsātības esamība, anomālais kariotips, ģenētiskais fons) no 40 līdz 80% pirmsimplantacijas embrijiem ir hromosomu anomālijas. Dažiem pāriem visi in vitro iegūtie embriji var būt hromosomālo anomāliju nesēji. Embrija ar hromosomālo patoloģiju embriotransfērs var beigties ar implantācijas neveiksmi, spontānu grūtniecības pārtraukšanos, nedzīva bērna vai bērna ar hromosomālo patoloģiju piedzimšanu.

Lai nepieļautu embriju ar bieži sastopamām un ar dzīvību savienojamām hromosomālām anomālijām embriotransfēru, nepieciešama PGD ar fluorescentas in situ hibridizācijas (FISH) vai polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) metodi. Šāda diagnostika tiek veikta uz polārķermenīšiem un atsevišķiem blastomēriem (embriju šūnām, kuras iegūtas biopsijas ceļā).

FISH metodes pamatā ir hromosomu DNS spēja izveidot stabilas hibrīdās molekulas ar zondēm, veidotām uz nukleīnskābju pamata, tieši uz histoloģiskajiem un citoloģiskajiem preparātiem. Ar šīs metodes palīdzību ir iespējams lokalizēt praktiski jebkuru DNS vai RNS secību tieši audos, šūnā, šūnas kodolā vai hromosomās. Metodi var izmantot PGD analīzei strukturālo hromosomālo pārbūvju gadījumos, biežāko aneiploīdiju noteikšanai pie aneiploīdu gametu rašanās paaugstināta riska, kā arī embriju dzimuma noteikšanai ar dzimumhromosomu saistīto slimību gadījumos.

PCR metodes pamatā ir DNS fragmenta kopiju miljon kārtīgs palielinājums in vitro ar fermentatīvās sintēzes palīdzību. Tas tiek izmantots monogēno slimību diagnosticēšanai, kaut gan šādi var atklāt arī aneiploīdiju vai delēciju klātbūtni.

Hromosomu, kuras visbiežāk iesaistās skaitliskajās kariotipa izmaiņās, skaita analīzi sauc par preimplantācijas ģenētisko skrīningu (PGS). PGS mērķis ir izmeklēt līdz 7-9 hromosomām (dzimumhromosomas X, Y, autosomas: 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22), kas ļauj atklāt līdz 70% visu pirmsimplantāciju embriju hromosomālo patoloģiju.

Pierādīts, ka PGS izmantošana IVF ciklos palielina implantācijas procentu, samazina spontāni pārtraukto grūtniecību skaitu, palielina veselu bērnu piedzimšanas iespējamību pāriem, kuri izmanto IVF procedūru.

Pacientu grupas, kurām saskaņā ar ESHRE (Eiropas cilvēka reprodukcijas un embrioloģijas biedrība) rekomendācijām ieteicama PGD procedūra ar FISH metodi, ir sekojošas:

  • pacienti ar anomālu kariotipu;
  • sievietes vecākajā reproduktīvajā vecumā (virs 35 g.);
  • vīrieši ar smagiem spermatoģenēzes traucējumiem;
  • pāri ar ierastu neiznēsātību (2 un vairāk spontāni aborti);
  • pāri ar atkārtotiem neveiksmīgiem IVF mēģinājumiem.

 

  1. II. Termini un skaidrojumi

Apaugļošanās – spermatozoīda un olšūnas saplūšana, kad, saplūstot abu gametu ģenētiskajam materiālam, izveidojas zigota.

Blastomērs – viena no embrija šūnām sākumdalīšanās stadijā (blastocistu ieskaitot).

Blastomēra biopsija – vienas vai divu embrija šūnu izņemšana ar mikromanipulācijas metodi.

Blastocista – 5-6 dienas attīstīts embrijs, kuram izveidojas ar šķīdumu pildīts blastoceles dobums, embrionālā šūnu masa un trofektoderma.

Embrijs – gametu apaugļošanās produkts no apaugļošanās brīža līdz embrioloģiskās stadijas beigām (astoņas nedēļas pēc apaugļošanās).

Embriju transfērs (embriotransfērs, ET) – embriju ievadīšana dzemdes dobumā.

Gametas – nobriedušas dzimumšūnas, spermatozoīdi (vīriešu) un olšūnas (sieviešu).

FISHfluorescent in situ hybridisation - fluorescentā hibridizācija in situ.

HSAhuman serum albumin – cilvēka seruma albumīns.

HTF human tubal fluid – cilvēka tubarā šķidruma analogs, kultivācijas barotne.

IVF in vitro fertilisation – ārpusķermeņa (medicīniskā)  apaugļošana.

ICSIintracytoplasmic sperm injection – viena spermatozoīda ievadīšana olšūnas citoplazmā ar mikromanipulācijas metodi.

MII – olšūna II mejotiskās dalīšanas metafāzes stadijā.

PGD – preimplantācijas ģenētiskā diagnostika.

PGS - preimplantācijas ģenētiskais skrīnings.

Polārķermenītis (olšūnas) pirmais - parādās olšūnai MII nobriešanas stadijā, otrais – olšūnas apaugļošanās laikā.

PZDpartial zona dissection – daļēja zona pellucida apvalka pārgriešana ar mikromanipulācijas metodi.

Zigota -  spermatozoīda un olšūnas saplūšanas rezultāts, šūna ar redzamiem diviem (mātes un tēva) pronukleusiem. 

Zona pellucida – spīdīgs apvalks, kas pieguļ olšūnas membrānai.

 

  1. III. MT realizācijas nosacījumi un apstākļi

Indikācijas (mērķa grupas), kādām pacientu grupām būtu jāveic PGD:

1. Pacienti ar augstu ģenētiski pārmantotās patoloģijas risku - pacienti ar gēnu vai hromosomu anomālijām: monogēnām (autosomām recesīvām vai dominantām, vai X- vai Y- saistītām), kā arī hromosomu aberācijām (strukturālām vai skaitliskām).

2. Pacienti ar augstu aneiploīdu gametu veidošanās risku:

  • sievietes vecumā virs 35 gadiem;
  • vīrieši ar smagiem spermatoģenēzes traucējumiem (oligoastenoteratozoospermija, oligospermija, azoospermija);
  • pāri, kuriem anamnēzē divi un vairāki agrīnie spontānie aborti;
  • pāri, kuriem anamnēzē divi un vairāki neveiksmīgi ārpus ķermeņa apaugļošanas mēģinājumi (šeit jābūt izslēgtiem pārējiem neveiksmes faktoriem).

Šiem pacientiem veic PGS, kura ietvaros var pārbaudīt līdz pat 9-12 prenatālai un postnatālai attīstībai svarīgākās hromosomas (8, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y).

3. Pacienti - gēnu mutāciju nesēji, kuriem slimība neizpaužas uzreiz, bet ir palielināts tās attīstības risks, vai tā var izpausties ar vēlo manifestāciju. Tie varētu būt dažādi onkogēni (piemēram, RB1- retinoblastomai, BRCA1 un BRCA2 – ģimenes krūts un olnīcu vēzim, NF1 in NF2 – neirofibromatozei u.c.), ATM gēns  - ataksijas-teleangioektāzijas vai Alcheimera slimības izraisītājs, un citi. Šai pacientu grupai var novērst minēto gēnu pārmantošanu nākamajās paaudzēs.

4. Pacienti, kuriem ģimenē ir bērns ar hematoloģisku slimību, kuram nepieciešama cilmes hemopoētisko šūnu pārstādīšana. Veseli HLA-identiski brāļi/māsas, kas piedzimst pēc IVF ar PGD,  var būt par nabassaites cilmes šūnu donoriem slimam bērnam. Šodien pasaulē tā nav reta prakse.

5. Mitohondriālas slimības, kuras izraisītas ar mitohondriju strukturāliem DNS bojājumiem un tiek pārmantotas pa mātes līniju, jo zigota, kas rodas pēc abu gametu saplūšanas, saņem gandrīz visus mitohondrijus no olšūnas. Ir aprakstīti ap 200 sindromi, daļu no kuriem var izslēgt ar PGD procedūru.

FISH metode ļauj atklāt vairākas DNS (RNS) secības vienā interfāzes kodolā vai vienā metafāzes platītē. PGD analīzē metodi var izmantot strukturālo hromosomālo pārbūvju gadījumos, biežāko aneploīdiju noteikšanai pie aneploīdu gametu rašanās paaugstināta riska, kā arī embriju dzimuma noteikšanai ar dzimumhromosomu saistīto slimību gadījumos.

PCR metodes galvenokārt tiek izmantotas monogēno slimību diagnosticēšanai, kaut gan šādi var atklāt arī aneploīdiju vai delēcijas.

Monogēnām slimībām ar PGD izmeklē polārķermenīšus un blastomērus. Sievietei, kura ir heterozigota slimības nesēja, pirmie polārie ķermenīši var būt trijos genotipiskos variantos: homozigoti ar mutāciju, homozigoti normāli un heterozigoti – ja ir noticis krosingovers (krustmija). Ja pirmais polārais ķermenītis ir homozigots ar mutāciju, tāda olšūna satur divas normāla gēna kopijas. Ja tas apstiprinās ar otrā polārā ķermenīša analīzi, embrijs, kas iegūts pēc šādas olšūnas apaugļošanas, var tikt pārnests atpakaļ sievietei. Ja pirmais polārais ķermenītis satur tikai normālus gēnus, embrijs nesīs mātes mutāciju. Ja pirmajā polārajā ķermenītī identificē gan normālu, gan mutantu gēnu (heterozigots polārais ķermenītis), secinājumu par embrija genotipu veic pamatojoties uz otrā polārā ķermenīša analīzēm. Otrais polārais ķermenītis, kas satur mutanto gēnu, atklāj, ka olšūnā palikusi normāla gēna kopija. Un otrādi, ja otrajā polārajā ķermenītī atrod normālu gēnu, tas nozīmē, ka olšūnā ir mutācija.

Ja slimības nesējs ir vīrietis, diagnostiku veic analizējot tikai blastomērus.

Pāriem, kuriem nepieciešama PGD, ārsts ginekologs, dzemdību speciālists sadarbībā ar ģenētisko konsultantu nosaka:

1) nepieciešamo PGD veidu un izstrādā izmeklēšanas un ārstēšanas plānu.

2) Veic nepieciešamās analīzes (infekcijas, hormonālās, ģenētiskās, spermogrammu un citus spermas testus) un izmeklējumus (USG, histeroskopiju u.c.).

3) Izvēlas superovulācijas stimulācijas protokolu, veic olnīcu hiperstimulāciju un nozīmē punkcijas dienu un laiku;

4) IVF ciklā olšūnas nopunktē no folikuliem un ar ICSI metodi apaugļo ar partnera spermatozoīdiem.

5) Pēc 16-18 stundām pēc apaugļošanās embriologs izvērtē olšūnu fertilizāciju.

6) Pareizi apaugļotas olšūnas un attiecīgi noteiktiem kritērijiem teicamas un labas kvalitātes trešās attīstības dienas embrijus atlasa PGD procedūrai.

 

  1. IV. MT metode
  2. 1. Pacientu sagatavošana pirms PGD procedūras

Pacientu sagatavošana pirms PGD procedūras ir būtisks etaps, jo, lai varētu veikt embriju PGD, pārim jāsaņem ģenētiskā konsultācija, jāveic nepieciešamās analīzes, kā arī jāiziet mākslīgās apaugļošanās cikls, kura rezultātā iegūst embrijus ģenētiskai diagnostikai.

Ārsts ginekologs, dzemdību speciālists sadarbībā ar ārstu ģenētiki atlasa pārus, kuriem nepieciešama preimlantācijas ģenētiskā diagnostika.

IVF ceļā iegūtu embriju bioloģiskā materiāla iegūšana un sagatavošana PGD notiek divos soļos:

1) bioloģiskā materiāla biopsija (olšūnu polārķermenīšu, embrija blastomēru);

2) šūnu sagatavošana ģenētiskai diagnostikai  (materiāla fiksācija uz stikla FISH citoģenētiskai analīzei vai materiāla fiksācija mikromēģenē PCR analīzei).

Iegūtais un fiksētais bioloģiskais materiāls tiek transportēts uz diagnostisko laboratoriju, kur tam ir iespējama FISH (fluorescentā in situ hibridizācija) molekulārā citoģenētiskā diagnostika vai PCR ģenētiskā diagnostika, atkarībā no tā, kāda ģenētiskā patoloģija dotajam pārim tiek izmeklēta. 

 

2. Bioloģiskā materiāla biopsija

2.1. Bioloģiskā materiāla biopsijai nepieciešamie aprīkojums, trauki un vides:

  • invertētais mikroskops, aprīkots ar mikromanipulātoriem un apsildāmo galdiņu;
  • Petri plates 35mm;
  • pipetes olšūnu (embriju) turēšanai;
  • biopsijas pipetes (polārķermenīšiem vai blastomēriem ar attiecīgu diametru);
  • PZD (partial zona dissection) pipete;
  • dimetilpolisiloksans pipešu iepildīšanai;
  • HTF ar 5%HSA vides pilieni  Petri plates vāciņā zem eļļas, preinkubēti CO2 inkubatorā;
  • biopsijas vide, preinkubēta CO2 inkubatorā.

Marķējot materiālu, uz katras platītes uzraksta pacienta vārdu, uzvārdu, dzimšanas gadu, datumu, blakus katram pilienam – izmeklējamās olšūnas (embrija) numuru saskaņā ar embrioloģisko protokolu.       

Parasti ārsts izvēlas PGD procedūrai veikt blastomēru biopsiju ar vai bez polārķermeņīšiem. Polārķermenīšu biopsiju jāveic 16-18st. pēc IVF/ICSI procedūras, kad izvērtē olšūnu apaugļošanās rezultātus; blastomēru biopsiju veic trešajā embriju attīstības dienā, kad tie atrodas 8 (6-10) šūnu stadijā. 

2.2.  Bioloģiskā materiāla biopsijas  gaita

Uz invertētā stereomikroskopa mikromanipulātoriem uzstāda  olšūnu (embriju) turētājpipeti, PZD un biopsijas pipetes, izlīdzina paralēli galdiņa virsmai. Pirms uzstādīšanas turētājpipeti un biopsijas pipeti piepilda ar dimetilpolisiloksanu, kas manipulāciju gaitā ļauj šķidrumam mikroinstrumentos plūst lēnāk. Iepriekš izvērtētu un atlasītu olšūnu (embriju) pārceļ sagatavotās plates pilienā ar HTF vidi. Platīti  ar šūnu noliek uz invertēta mikroskopa  apsildāmā galdiņa. Vispirms veic mehānisko daļēju šūnas apvalka (zona pellucida) pārgriešanu, izveidojot atveri biopsijas pipetes ievadīšanai zem apvalka. Griezums var būt T-, V-vai X-veidīgs.

Lai pārgrieztu zonu, vispirms olšūnu (embriju) piefiksē pie turētājpipetes. Ja veic polārķermenīšu biopsiju, tad olšūnu pagriež tā, lai abi polārķermenīši atrodas uz 12h viens aiz otra. Tangenciāli pārdur zona pellucida apvalku ar PZD adatu. Zigotu atbrīvo no turētājpipetes, adatu ar uzdurtu apvalku pieved pie turētājpipetes apakšējās malas, piespiež pie tās un vairākas reizes virza no malas uz malu, tādejādi pārgriežot apvalku. Līdzīgi veic griezumu arī embrijam, izvēloties malu, kur no embrija šūnām līdz apvalkam ir lielāka atstarpe.

Bioptējot polārķermenīšus, olšūnu fiksē tā, lai tie atrodas uz 12h un mikroskopa fokusā, tad caur izveidoto atveri zem apvalka ievada biopsijas pipeti un uzmanīgi iesūc pirmo un otro polārķermenīti. Biopsijas pipeti ar polārķermenīšiem izved no apvalka,  šūnas pārnes uz blakus pilienu, kur lēnām tos izlaiž tīrajā vides pilienā.

Veicot blastomēru biopsiju, embriju fiksē uz turētājpipetes tā, lai griezums būtu uz 3h un mikroskopa fokusā. Uzmanīgi ievada biopsija pipeti zem apvalka un lēnām biopsē tuvāko blastomēru. Blastomēru izvēlās tādu, lai tajā būtu redzams kodols. Tad pipeti ar blastomēru uzmanīgi izved no apvalka, atbrīvo embriju no turētājpipetes, bet bioptēto šūnu izlaiž blakus tīrajā pilienā.

Bioptētās olšūnas (embrijus) pārstāda iepriekš sagatavotajā un marķētajā jaunajā inkubācijas platē un liek inkubātorā tālākai audzēšanai;  biopsijas plati ar polārķermenīšiem (blastomēriem) atstāj fiksācijai.

Procedūru atkārto katrai apaugļotai olšūnai (zigotai) vai katram izmeklējamam embrijam.

Bioloģiskā materiāla biopsijas rezultātā fiksācijai paliek plates ar bioptēto materiālu (olšūnu polārķermenīsiem vai embriju blastomēriem); plates ar nobioptētiem embrijiem tiek atgrieztas inkubātorā tālākai kultivēšanai. Katrs embrijs un tā šūna(s) darba gaitā tiek attiecīgi numurētas. Embriji, lai izslēgtu netīšu to sajaukšanu, tiek kultivēti platēs ar individuālajām ailītēm katram embrijam. Plates ar numurētām nobioptētām šūnām pārvieto to fiksācijai.

 

3. Šūnu sagatavošana FISH citoģenētiskai diagnostikai (fiksācija uz priekšmetstikla)

3.1.  Bioloģiskā materiāla fiksācijai uz priekšmetstikla nepieciešamie aprīkojums, trauki un vides:

  • invertētais mikroskops ar fāzes kontrastu ar palielinājumu 100x (200x).
  • Fiksators: metanola un ledus etiķskābes maisījums (3:1), pagatavots 2h pirms procedūras un uzglabāts saldētavā pie -200C.
  • Priekšmetstikli ar SuperFrost pārklājumu un slīpētu malu.
  •  2 mikrokapilāri: 40-50 mkm polārķermenīšu vai 60-100 mkm blastomēru pārnešanai.
  • Mikrokapilārs fiksatora pievienošanai.
  • 35mm Petri plate ar hipotonisku šķīdumu (1% nātrija citrāts ar 0,6% BSA, Bovine Serum Albumin).
  • Stikla skrāpeklis.
  • Parastais zīmulis.

 

3.2. Bioloģiskā materiāla fiksācijai uz priekšmetstikla gaita

Biopsijas materiālu fiksē uz priekšmetstikliem ar SuperFrost pārklājumu un slīpētu malu, uz kuras ar parasto zīmuli raksta pacienta vārdu, uzvārdu, datumu, embriju numuru un materiāla tipu (polārķermenīši vai blastomēri). Uz stikla virsmas ar skrāpekli ievelk apli 6-8mm diametrā, kuru sadala 4, 6 vai 8 daļās. Katrā daļā tiek fiksēts 1 blastomērs (vai polārķermenītis).

Hipotoniskais šķīdums tiek ieliets 35mm Petri platē, kuras apakšā ar marķieri iezīmē apli (vai krustu.) Kapilārā ievelk nelielu daudzumu hipotoniskā šķīduma un zem mikroskopa kontroles  blastomēru (polārķermenīti)  pārceļ no biopsijas plates uz hipotonijas plati apļa (krusta) rajonā, kur atmazgā to no eļļas (līdz 5 min). Pēc kā minimālā hipotonijas apjomā blastomēru (polārķermenīti)  pārceļ uz fiksācijas priekšmetstiklu. Kad hipotoniskais šķīdums ar šūnu uz stikla ir gandrīz izžuvis, pievieno pirmo fiksatora pilienu. Kad fiksators gandrīz nožuvis, pievieno nākamo, atkārtojot fiksatora pilināšanu tik ilgi, kamēr no kodola tiek noskalota citoplazma. Ir jāuzmanās, lai fiksācijas laikā kodols neaizpeld, kā arī lai tam apkārt nepaliek pārāk liels citoplazmas daudzums, kas var traucēt turpmākam hibridizācijas procesam. Kad kodols ir fiksēts, no stikla apakšpuses ar skrāpekli un uz stikla slīpētās malas ar parasto zīmuli pieraksta bioptētā embrija numuru. Fiksāciju atkārto katra embrija ģenētiskajam materiālam.

Pēc biopsijas un fiksācijas veikšanas tiek sastādīta pavadlapa, kur pieraksta aktuālo informāciju: pacienta vārdu, uzvārdu, vecumu, punkcijas datumu, biopsijas datumu un iegūtā materiāla veidu katram embrijam, kā arī diagnozi un pētāmo hromosomu skaitu un numurus. Pavadlapā pacienta datus aizpilda un paraksta paši pacienti, diagnozi un veicamo izmeklēšanas plānu paraksta ārstējošais ārsts, bet biopsijas un fiksācijas materiāla aprakstu ar zīmējumiem veic un paraksta embriologs, kā arī tiek atzīmēta kontaktpersona un tās kontakti rezultātu saņemšanai un darba jautājumu risināšanai. 

Stiklus ar fiksētu materiālu ieliek transportēšanas konteinerā un kopā ar pavadlapu ar eksprespastu vai kurjeru nosūta uz PGD laboratoriju, kur tiek veikta FISH molekulārā citoģenētiskā diagnostika. Par saņemto materiālu parakstās atbildīgā persona. Visa analīze tiek veikta diennakts laikā, lai uz embriotransfēra dienu rezultāti būtu gatavi. 

 

4. Šūnu sagatavošana PCR molekulārai diagnostikai (fiksācija mikromēģenē - tubing)

Standarta sterilos apstākļos ne vienmēr izdodas izvairīties no paraugu kontaminācijas ar svešu DNS. Laboratorijā, kas veic pirmsimplantācijas DNS analīzi, jābūt atsevišķiem ledusskapim un saldētavai, mikrocentrifūgai, sterilam darba galdam, pipešu komplektam, kas tiek izmantoti tikai pirmajai diagnostikas kārtai un amplifikātoram.

Strādājot ar atsevišķām šūnām, ir jāievēro virkne īpašu noteikumu:

1) vienmēr strādāt cimdos;

2) nekad neatvērt mēģenes, kuras satur DNS vai PCR produktu, pirmās kārtas PCR telpā;

3) neatļaut nepiederīgiem darbiniekiem atrasties laboratorijā, kur notiek pirmatnējā materiāla apstrāde un reaģentu sagatavošana PCR pirmajai kārtai.

4) Pipetes, statīvus un citu laboratorijas aprīkojumu, kurus izmanto PCR pirmajā kārtā, neizmantot citās laboratorijās;

5) pirms darba visas virsmas un instrumentus nepieciešams apstrādāt ar DNA Contamination Removal Solution (DNA-OFF);

6) PCR reaģentus sadalīt alikvotās un uzglabāt nelielos apjomos, lai samazinātu atsaldēšanas un atvēršanas reižu skaitu.

Lai izslēgtu iespējamās diagnostikas kļūdas, saistītas ar DNS kontamināciju, katrai analīzei jāveic pozitīvās un negatīvās kontroles. Pozitīvās kontrolēs lieto pacienta DNS vai atsevišķas šūnas, tas ļauj pārliecināties, ka analīzes laikā nebija novirzes. Kā negatīvu kontroli izmanto ūdeni, kas bija izmantots reaktīvu pagatavošanai, vai lītiskus buferus bez polārķermenīšiem un blastomēriem, kas ņemti no mikromanipulāciju pilieniem. Negatīvās kontroles kalpo, lai atklātu iespējamu reaģentu kontamināciju ar svešu DNS, kas var novest pie diagnostikas kļūdām.

 

4.1. nepieciešamais pre-PCR (tubing) aprīkojums un materiāli

1) Vortekss (mikrocentrifūga).

2) Horizontāls lamināra darba galds ar UV gaismu.

3) Stereomikroskops.

4) Mazs ledusskapis.

5) Maza saldētava.

6) Ledus pārslu ģenerators, vai gatavas ledus pārslas.

7) Ledus konteiners.

8) Sausais ledus (transportēšanai).

9) Pipete 1-20 µl (Finnpippet).

10) Uzgaļi ar filtriem 20 µl (Finnpippet), autoklavēti.

11) Stikla glāzes autoklāvēšanai x2.

12) Folija autoklāvēšanai.

13) Špāteļi, autoklavēti folijā x3.

14) Planšetes PCR mēģenēm, autoklavētas.

15) 0.2 ml plāno sieniņu PCR mēģenes, autoklavētas.

16) Mutes pipetes ar rezerves daļām (filtriem, uzgaļiem).

17) Paraffins.

18) Petri plates 50mm.

19) Pipetors.

20) Seroloģiskās pipetes eļļai, 10ml.

21) Lokanās pipetes 75 mkm.

22) Minerāleļļa.

23) Disociācijas bufers (Ca2+-Mg2+ brīva biopsijas vide).

24) BSA (Bovine Serum Albumin).

25) Etanols 70% un 96%/ DNA-EXitus plus (lamināra tīrīšanai).

26) Aizsargapģērbs, maska, cepure, laboratorijas apavi.

27) Cimdi (garie).

 

4.2. Blastomēra (polārķermenīša) pārnešana uz PCR mēģeni (tubing)

Šo soli jāveic uz lamināra darba galda istabas temperatūrā pirms-PCR laboratorijā. Darbiniekam, kurš veiks šūnu pārnešanu uz PCR mēģenēm, jāstrādā cimdos, tīrā ķirurģiskā apģērbā, cepurē un maskā.

Veicot blastomēru biopsiju jāpārliecinās, ka tiek bioptēti tikai blastomēri ar skaidri redzamu kodolu. Blastomēri tiek paņemti no biopsijas plates un trīs reizes skaloti pilienos ar Ca2+-Mg2+ brīvu vidi, kurai pievienots BSA 4 mg/ml, zem minerāleļļas. Tad blastomērus stereomikroskopa kontrolē pārceļ 200µl PCR mēģenēs, kuras iepriekš piepildītas ar 2,5 µl ALB (alkalīno līzes buferu). Pārceļot blastomēru, to ļoti uzmanīgi paņem mikropipetes uzgalī, cenšoties turēt pēc iespējas tuvāk uzgaļa galam. Viena tukša mēģene kontrolei (blank) tiek ņemta priekš katras parauga šūnas, kurā tiek ievietots vides no skalošanas piliena paraugs. Mikropipetes uzgalis tiek izskalots ar Ca2+-Mg2+ brīvu vidi starp paraugiem.

Mēģenes tiek marķētas sekojoši:

pirmā embrija pirmā šūna               e1.1

attiecīgā tukšā mēģene                  b1.1

pirmā embrija otrā šūna                 e1.2

attiecīgā tukšā mēģene                  b1.2

...................................................................

ceturtā embrija pirmā šūna              e4.1

attiecīgā tukšā mēģene                   b4.1     utt.

Papildus aplis tiek uzvilkts uz tukšās mēģenes vāka (blanc control).

Visas procedūras laikā PCR mēģenes tur uz ledus (izņemot momentu, kad zem stereomikroskopa tiek pārnests blastomērs), un tad tās pēc iespējas ātrāk tiek sasaldētas -200C vai -800C temperatūrā. Lai iegūtu labākus amplifikācijas rezultātus, šūnām jābūt sasaldētām vismaz 30 minūtēs. Transportēt tās drīkst tikai uz sausā ledus. Mēģenēm jābūt cieši uzliktām uz statīva, statīva vākam stingri aizvērtam, lai izvairītos no izkrišanas transportēšanas laikā. Pārklāt ar papildus sauso ledu.

Pavadlapā, kas tiek aizsūtīta elektroniski, ieraksta pacientu datus (vārdu, uzvārdu, dzimšanas datumu), diagnozi un testēšanas veidu, kā arī embrioloģiskā protokola datus (punkcijas datumu, embriju skaitu un kvalitāti, bioptēto blastomēru skaitu un kvalitāti). Pavadlapā tiek atzīmēta kontaktpersona un tās kontakti rezultātu saņemšanai un darba jautājumu risināšanai.

Sasaldētās mēģenes  ar fiksētu materiālu ar eksprespastu vai kurjeru nosūta uz PGD laboratoriju, kur tiek veikta PCR molekulārā diagnostika. Par saņemto materiālu parakstās atbildīgā persona. Visa analīze tiek veikta diennakts laikā, lai uz embriotransfēra dienu rezultāti būtu gatavi.

 

  1. V. MT materiāli tehniskais nodrošinājums

5.1. Ārstniecības personas

MT drīkst veikt laboratorijas ārsts vai laboratorijas speciālists, biologs, kas ir apguvuši medicīnisko tehnoloģiju.

5.2.  Citas medicīniskās tehnoloģijas

Lai veiktu MT drīkst izmantot tikai likumīgi Latvijas tirgū ievietotus ārstniecības līdzekļus un Ārstniecībā izmantojamo medicīnisko tehnoloģiju datu bāzē reģistrētas metožu medicīniskās tehnoloģijas.

5.3. Telpas

MT veic ārstniecības iestādes medicīnas laboratorijā, kas atbilst un ir aprīkota atbilstoši normatīvo aktu prasībām.

 

Rīga.

2015.gada 4.septembrī                                         Ilona Joņina, biologs

 

MT 15-023